Aplicações

Esta aplicação é apropriada para a sequenciação de genomas de organismos novos ou ainda não sequenciados. A Genoinseq pode sequenciar genomas de bactérias, plasmídeos, fosmídeos, vírus ou fungos na plataforma MiSeq^® ou NextSeq^®.

O nosso serviço inclui a análise bioinformática dos dados. Após a sequenciação e controlo de qualidade (QC), as reads são assembladas em contigs e os genes previstos e anotados com o PGP V2 (Prokaryote Gene Prediction*). Os resultados finais incluem o QC, os dados em bruto (FASTQ), contigs, métricas de assemblagem e os ficheiros de anotação gff e GenBank. Auxiliamos ainda no processo de deposição desta informação em bases de dados públicas.

*Egas et al., 2014, doi: 10.4056/sigs.5661021

A resequenciação de genomas permite obter um catálogo de variantes para estudar a diversidade genética em indivíduos. Os genomas podem ser resequenciados na plataforma na plataforma MiSeq^® ou NextSeq^® de acordo com o número de amostras e o tamanho dos genomas.

Após a sequenciação e controlo de qualidade, as sequências são mapeadas contra a sequência do respetivo genoma de referência para identificar SNPs, pequenas inserções e deleções (Indels) e variantes estruturais. As variantes podem ser anotadas para inferir o seu impacto (por exemplo conservação, tipo e variante, previsão do efeito no gene ou região reguladora) caso a anotação esteja disponível. Os resultados finais incluem o QC, os dados em bruto (FASTQ), os ficheiros de alinhamento (por exemplo os ficheiros BAM) e os ficheiros de anotação (por exemplo VCF). 

A sequenciação de exomas consiste na sequenciação de todos os exões do genoma humano para a identificação de variantes genéticas responsáveis por doenças Mendelianas (85% das mutações causadoras deste tipo de doenças encontram-se em exões), doenças complexas ou outros traços relacionados com a saúde. A Genoinseq sequência exomas nas plataformas NextSeq^® e Ion Proton™.

Para a análise dos exomas a Genoinseq desenvolveu o ExomeLoupe, uma pipeline específica para a deteção, anotação e visualização de variantes no exoma. O utilizador pode filtrar variantes por gene, genótipo, anotação estrutural, efeito da variante, polimorfismos conhecidos, frequência na população ou fenótipos (HPO).

Os painéis de genes permitem dar resposta a questões biológicas ou clínicas pelo estudo de alterações em genes associados ou potencialmente associados a uma doença ou fenótipo. A maior vantagem relativamente aos exomas é uma maior cobertura de sequenciação.

Os painéis de genes podem ser selecionados com base em genes já associados a doenças (painéis prontos a usar) ou desenhados para incluir genes ou regiões genómicas de interesse (painés à medida). A Genoinseq sequencia painéis nas plataformas MiSeq^®, NextSeq^® e Ion Proton^TM.

Esta aplicação permite a análise da expressão génica de forma a estudar a extensão e complexidade do transcriptoma. O RNA-Seq permite ainda a descoberta e anotação de transcritos completos ou a caracterização de splicing alternativo ou poli-adenilação. Dependendo do tamanho do genoma ou do número de amostras, a sequenciação de RNA-Seq pode ser efetuada nas plataformas MiSeq^® NextSeq^®. A sequenciação de transcriptomas de novo está também disponível.

Para obtenção de resultados, as sequências são mapeadas contra o genoma ou transcriptoma de referência anotado. A expressão diferencial é calculada por contagem de sequências, normalização e análise estatística. Os resultados finais incluem QC e dados em bruto (FASTQ). A expressão diferencial e anotação dos transcritos é disponibilizada em plataformas web “user-friendly” para visualização e análise de resultados. 

A análise da expressão de genes específicos pode ser uma alternativa à sequenciação do transcriptoma completo.  As soluções existentes incluem painéis prontos a usar ou painés desenhados à medida para incluir genes de interesse. A Genoinseq sequencia painéis nas plataformas Ion Proton^TM, MiSeq^® ou NextSeq^®.

Esta aplicação é apropriada para a descoberta de pequenos RNAs ou para o estudo de perfis de expressão. Estas sequências de 10 a 40 nucleótidos têm um papel importante na regulação pós-transcrição da expressão genética. Os pequenos RNA incluem small interfering RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs) ou Piwi-associated RNAs (piRNAs).

Após sequenciação na plataforma MiSeq^® ou NextSeq^® as reads obtidas são mapeadas contra o genoma de referência do organismo em estudo ou contra a informação de bases de dados de pequenos RNAs. A expressão diferencial é calculada por contagem de sequências, normalização e análise estatística. Os resultados finais incluem QC, dados em bruto (FASTQ), expressão diferencial e anotação dos pequenos RNAs. 

A sequenciação em larga escala é muito utilizada para caracterizar a composição e diversidade de comunidades microbianas de ambientes naturais. Esta aplicação baseada em amplicões envolve a amplificação de uma região de um gene específico, geralmente o gene 16S rRNA para bactérias ou a região ITS (Internal Transcribed Spacer) de fungos. Esta abordagem é também utilizada com sucesso para a identificação de membros de comunidades eucariotas através da sequenciação do gene 18S rRNA ou do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI).

Após a sequenciação na plataforma MiSeq^®, as sequências são filtradas por qualidade, assembladas (forward e reverse) e mapeadas contra taxa de referência, ou agrupadas em clusters a um nível pré-determinado de identidade de sequência, designado OTU (Operational Taxonomic Units) e atribuído o taxon com base na homologia de sequências. Os resultados finais incluem o QC, os dados em bruto (FASTQ), a identificação taxonómica dos OTU e respetiva abundância por amostra, e a alfa e a beta diversidades, quando aplicável. 

Esta abordagem de “shotgun” é adequada para o estudo de perfis taxonómicos e funcionais de comunidades microbianas. Esta aplicação envolve a fragmentação de DNA e a sequenciação em profundidade dos pequenos fragmentos gerados. A Genoinseq sequencia metagenomas de comunidades microbianas nas plataformas MiSeq^®e NextSeq^®.  

A reconstrução do perfil de taxonomia ou função envolve uma comparação direta das sequências ou contigs a um catálogo de referência de genes ou genomas microbianos. O perfil funcional pode ser inferido por comparação com bases de dados de proteínas ou domínios proteícos como o KEGG, Clusters of Orthologous Groups (COGs), Swiss-Prot, Pfam ou InterPro .

Os microssatélites constituem uma ferramenta importante para estudos ecológicos e de evolução. Para organismos não modelo ou para os quais não existe ainda uma sequência do genoma, a sequenciação aleatória e parcial do genoma pode ajudar a identificar estes marcadores. A Genoinseq utiliza a plataforma MiSeq^® ou NextSeq^®para esta aplicação. Os resultados finais incluem o QC, os dados em bruto (FASTQ) ou a identificação de microssatélites com ferramentas bioinformáticas adequadas. 

A Genoinseq pode ajudar na identificação da aplicação mais adequada às suas necessidades. Por favor contacte os nossos serviços se necessitar da nossa colaboração. Podemos trabalhar em conjunto para estabelecer uma abordagem de sequenciação ou uma pipeline bioinformática que responda adequadamente às suas questões biológicas ou clínicas.